Lyme review: immunoblots

Immunoblots

Description des bandes

Les blots de Labodia sont produits à partir d'une souche de B. garinii. Des blots préparés à partir de B. burgdorferi ss auraient un aspect très semblable mais présenteraient une bande d'Osp B, une protéine qui n'est pas exprimée par B. garinii. Des blots produits avec B. afzelii seraient assez différents et montreraient des bandes de bas poids moléculaire (inférieur à 20 kDa).

Le tableau ci-dessous décrit la plupart des protéines qui peuvent être révélées par le sérum d'un patient sur un blot IgG. Seules 5 d'entre elles doivent être identifiées par l'utilisateur pour établir un diagnostic.

PM	Description
93 kDa	p100 : protéine chromosomique très spécifique du genre Borrélia; la réponse des patients est surtout de type IgG et apparaît au cours des infections chroniques; les bandes à 93 kDa sont étroitement associées aux stades tardifs des borrélioses.
73 kDa	Bande spécifique correspondant probablement à l'ADN bactérien.
62-72 kDa	Protéines de choc thermique (HSP); ces bandes ne sont pas spécifiques d'une borréliose et se retrouvent après de nombreuses infections bactériennes. Sans valeur diagnostique.
66 kDa	Marqueur spécifique des borrélioses, dépend de l'espèce infectante.
60 kDa	Antigène commun à beaucoup de bactéries. Sans valeur diagnostique.
58 kDa	Marqueur spécifique des borrélioses, dépend de l'espèce infectante.
46 kDa	Marqueur spécifique des borrélioses, dépend de l'espèce infectante.
41 kDa	Flagelline : cette protéine n'est pas spécifique du genre Borrelia mais est prise en compte lors de l'interprétation des résultats; il existe des réactions croisées avec d'autres spirochètes; une bande de flagelline apparaît dans les stades précoces comme dans les infections chroniques.
39 kDa	p39 : protéine très spécifique du genre Borrelia.
37 kDa	Cette protéine est considérée comme un marqueur des infections précoces mais sa spécificité exacte est mal connue.
32,5 kDa	Osp A : protéine de surface très spécifique de B. garinii.
28 kDa	Osp D : protéine de surface.
22-23 kDa	Osp C : protéine de surface très spécifique de B. garinii et marqueur des infections précoces.
18 kDa	p18 : cette protéine spécifique est un excellent marqueur des infections chroniques.

Tableau X : bandes protéiques décelables sur les blots Labodia (IgG).

Le système de score de Labodia

Aux Etats-Unis, le CDC a établi des règles précises pour l'interprétation des Western blots. En Europe, en dépit des efforts de l'EUCALB, il n'a pas été possible d'aboutir à un consensus. Notre approche diffère des critères américains. Au lieu de demander à l'utilisateur d'identifier un grand nombre de bandes (par ex. au moins 8 sur un total de 13 pour un résultat positif), nous avons préféré nous concentrer sur 5 ou 6 bandes, y compris des protéines très spécifiques (p39, Osp A, Osp C, p18) et d'évaluer en outre leur intensité. Cette méthode présente 3 avantages :

u	Pour l'utilisateur, le temps de lecture est réduit et, surtout, le risque d'erreur est limité.
u	Dans le cas des blots IgM où les profils ne présentent que peu de bandes (en général 2), nous pouvons utiliser un marqueur assez peu spécifique, la flagelline, car une bande intense est significative tandis qu'une bande faible est courante dans la population normale.
u	S'habituer à évaluer l'intensité des bandes est très utile lorsqu'il s'agit d'interpréter des paires d'échantillons sans séroconversion.

Notre système de score a été validé sur de très nombreux cas cliniques. Des simulations sur ces données ont montré que le fait d'inclure des bandes supplémentaires dans l'analyse des résultats n'améliorait en rien la sensibilité et la spécificité des trousses.

Comment ça marche ?

Chaque coffret contient un cadre de lecture composé d'une bandelette exposée au contrôle positif de la trousse fixé sur une carte référençant les principales bandes visibles sur cette bandelette. Dans la notice d'utilisation de la trousse figurent les intensités de 3 de ces bandes, exprimées en points sur une échelle de 1 à 3. La p39 aura, par exemple, toujours une intensité de 1 point tandis que la flagelline aura une intensité de 2 ou de 3 points (selon le lot de contrôle positif). L'utilisateur identifie d'abord les bandes caractéristiques puis évalue leur intensité selon cette échelle. En additionnant les points obtenus pour chacune des bandes, on obtient le score de l'échantillon et on peut ainsi rendre un résultat positif ou négatif.

Les bandes à évaluer sont les suivants : p100, flagelline, p39, Osp A, Osp C et dans les cas d'échantillons faiblement réactifs en IgG, p18.

Lecture des profils IgM

Dans les cas d'arthrite de Lyme et d'acrodermatite, la détection des IgM est dépourvue d'intérêt. Dans ces infections tardives, un immunoblot IgG suffit à fournir un résultat positif. En IgM, le résultat peut être négatif ou positif, mais est de toute façon sans valeur diagnostique. Par contre, dans les cas d'érythème migrant et de neuroborréliose (cette présentation clinique recouvre des stades précoces comme des infections chroniques), la recherche des IgM est absolument indispensable.

Dans notre étude, la recherche des IgG et des IgM en parallèle a fourni une sensibilité de 97 % pour les EM et les neuroborrélioses alors que la seule recherche des IgG donne une sensibilité de 77 %.

Fig. 20. Influence de la recherche en parallèle des IgG et des IgM sur la sensibilité des immunoblots.

Les blots positifs en IgM présentent presque toujours 2 bandes, parfois 3 :

la flagelline (p41) est présente dans 100 % des cas d'érythème migrant et de neuroborréliose,
l' Osp C (22-23 kDa) est présente dans 80 % des érythèmes migrants et des neuroborrélioses,
l' Osp A (32,5 kDa) est assez rare dans les érythèmes migrants et est présente dans 10 à 20 % des neuroborrélioses.

< 4 points	Négatif
= 4 points	Négatif si l'Osp C et la flagelline ne sont pas visibles
= 4 points	Positif si l'Osp C et la flagelline sont présentes
> 4 points	Positif si l'Osp C et la flagelline sont présentes

Tableau XI : Critères d'interprétation des immunoblots IgM (Labodia).

Toutefois, ni la flagelline ni l'Osp C ne sont très spécifiques d'une infection en cours. Dans les zones d'endémie telles que la Suisse, 70 % de la population normale présentent une bande de flagelline. Pour l'Osp C, la proportion tombe à 20 %. L'Osp A, par contre, est un marqueur spécifique que l'on ne retrouve pas dans la population normale.

L'intensité de la flagelline fournit une aide appréciable au diagnostic différentiel : la bande est généralement faible (intensité d'un point) dans la population normale et plus marquée (2 points) en cas d'érythème migrant ou très forte (3 points) en cas de neuroborréliose. La même remarque s'applique à l'Osp C. Cette bande est souvent très intense sur nos blots car la souche VS102 qui est utilisée pour leur préparation exprime fortement cette protéine.

Fig. 19. Immunoblot IgM (cadre de
lecture de la trousse).

Sur ce cadre de lecture, l'échelle d'intensité est définie comme suit :

1 point : bande à 60 kDa
2 points : flagelline
3 points : Osp C

La bande à 60 kDa sert uniquement d'exemple de bande de faible intensité et ne doit jamais être inclue dans le calcul du score de l'échantillon.

Si cette bandelette était considérée comme un échantillon de patient, le score serait de : 2 (Osp C) + 2 (flagelline) = 5 è positif.

Lecture des profils IgG

Trois approches peuvent être envisagées pour l'interprétation des blots IgG :

Three different approches can be considered for IgG blot interpretation:

Analyse standard utilisant le système de score de Labodia : l'interprétation est liée aux 5 ou 6 bandes figurant en gras sur le cadre de lecture.
Certains laboratoires ajoutent aux résultats positifs un commentaire concernant la probabilité d'une infection précoce ou tardive.
Approche qualitative utilisant plus de 6 bandes.

u Analyse standard

La figure 20 montre un cadre de lecture typique de la trousse. L'échelle d'intensité est définie comme suit :

1 point : Osp A
2 points : 60 kDa
3 points : flagelline

Fig. 20. Immunoblot IgG (cadre de lecture de la
trousse).

Les bandes utilisées pour l'interprétation sont décrites dans le tableau XII

PM	Description
93 kDa	p100 : bande nette d'intensité variable (3 points dans le cas de la fig. 20 ) figurant toujours à l'extrémité supérieure de la bandelette.
60 kDa	Cette bande n'a pas de valeur diagnostique mais est indiquée pour 2 raisons : elle sert d'exemple d'intensité de bande, comme elle est présente sur la quasi totalité des bandelettes de patients, elle peut être utilisée comme la ligne de départ (index line) pour aligner une bandelette avec le cadre de lecture.
41 kDa	Flagelline : lorsque cette bande est présente, elle est large (apparaît parfois comme un doublet). La flagelline doit être présente sur les blots positifs mais son intensité est un critère d'interprétation majeur parce qu'elle est également présente dans 90 % de la population normale.
39 kDa	p39 : lorsqu'elle est présente, il s'agit toujours d'une bande faible et étroite (1 point) située juste sous la flagelline. Dans la plupart des cas, la p39 forme un triplet caractéristique avec la flagelline et la bande à 37 kDa.
37 kDa	Cette bande n'est pas à prendre en considération lors du calcul du score mais elle est indiquée pour éviter toute confusion avec la p39 (la bande à 37 kDa est plus fréquente que la p39).
32.5 kDa	Osp A : lorsqu'elle est présente, cette bande est assez large mais souvent de faible intensité (1 point dans le cas de l'exemple).
28 kDa	Osp D : non comprise dans le score.
22-23 kDa	Osp C : lorsqu'elle est présente, la bande est large et souvent très intense (2 points dans le cas de l'exemple).
18 kDa	p18 : lorsqu'elle est présente, il s'agit d'une bande étroite, d'intensité variable (1 point dans le cas de l'exemple) située à l'extrémité inférieure de la bandelette.

Tableau XII : Bandes figurant sur les cadres de lecture IgG.

L'interprétation des résultats est basée sur 5 bandes, sauf si la bandelette présente plusieurs bandes faibles dont des bandes spécifiques. Dans ce cas, on inclut la p18 dans le calcul du score.

< 4 points	Négatif
4 - 5 points	Négatif si seules 3 bandes (y compris la p18) sont présentes
4 - 5 points	Faible positif si la flagelline et 3 bandes spécifiques (y compris la p18) sont présentes
6 points	Négatif si seules 3 bandes sont visibles
6 points	Positif si 3 bandes spécifiques au moins sont présentes
> 7 points	Positif

Tableau XIII : Critères d'interprétation des immunoblots IgG (Labodia).

Calcul du score dans le cas de la figure 20 :
3 (93 kDa) + 3 (41 kDa) +1 (39 kDa) +1 (32,5 kDa) +2 (22-23 kDa) = 10 points è positif.

Profils IgG dans les érythèmes migrants

Deux paramètres doivent être pris en considération à ce stade précoce de l'infection.

Les échantillons positifs présentent généralement peu de bandes.
Dans les zones d'endémie, beaucoup d'individus sains conservent parfois pendant plusieurs années des cicatrices immunologiques d'une exposition antérieure à Borrelia.

Dans ces conditions, il est souvent utile d'inclure la p18 dans l'interprétation, sachant qu'elle n'est présente que dans 25-30% des érythèmes migrants mais qu'elle est quasiment toujours absente chez les sujets sains.

Comme les blots IgM, les blots positifs en IgG présentent presque toujours une forte réaction à la flagelline. L'Osp C est très courante, la p39 assez rare et l'Osp A est présente dans la moitié des cas.

La détection en parallèle des IgM est indispensable.

Fig. 21. Profils IgG dans les érythèmes migrants : fréquence des bandes (bas) et intensité moyenne (haut).

Si le diagnostic est négatif ou douteux, on demandera un échantillon supplémentaire après quelques semaines. Les paires d'échantillons doivent être testées lors de la même manipulation et avec le même lot de bandelettes.

Profils IgG dans les arthrites

L'interprétation est généralement très aisée car à ces infections chroniques correspondent des profils très spectaculaires, riches en bandes de forte intensité. Toutes les bandes spécifiques sont généralement présentes à l'exception de l'Osp A (50 % des positifs dans notre étude).

Fig. 22. Profils IgG dans les arthrites chroniques : fréquence des bandes.

Profils IgG dans les acrodermatites

Globalement, les échantillons positifs fournissent des résultats semblables à ceux observés dans les cas d'arthrite : scores élevés, nombreuses bandes (avec la même remarque concernant l'Osp A).

Toutefois, inclure la p18 dans le calcul du score peut s'avérer utile si l'échantillon est faiblement réactif. La plupart des acrodermatites sont dues à B. afzelii et les réactions croisées entre protéines de B. garinii et B. afzelii sont moins bonnes qu'avec les protéines de B. burgdorferi ss.

Profils IgG dans les neuroborrélioses

Comme cette présentation inclut des infections précoces et tardives, les profils IgG peuvent s'apparenter à ceux des arthrites comme à ceux des érythèmes migrants. Inclure la p18 dans le calcul du score peut s'avérer utile si l'échantillon présente de nombreuses bandes de faible intensité.

Fig. 23. Immunoblots IgG dans les neuroborrélioses : fréquence des bandes.

Si les immunoblots de Labodia doivent être utilisées pour tester des échantillons de LCR, le système de score ne peut pas leur être appliqué et l'interprétation se fera uniquement à partir de la présence ou de l'absence de bandes dans le LCR.

u Infection précoce ou tardive ?

Cette évaluation se fait surtout à partir de profils IgG car la présence d'IgM (flagelline et Osp C) n'est pas incompatible avec une infection tardive; on a observé la persistance d'IgM dans certaines arthrites plusieurs mois après l'antibiothérapie.

D'une manière générale, plus le profil IgG est riche en bandes, plus les chances d'être en présence d'une infection chronique sont grandes.
En outre, on considère que les premières bandes à apparaître sont la flagelline et les protéines de surface (Osp A et Osp C) ainsi qu'une bande à 37 kDa.
A côté de ces marqueurs typiques des infections débutantes, d'autres bandes viennent s'ajouter lorsque l'infection devient chronique : la p100 (93 kDa) et la 18 kDa.

u Analyse de bandes supplémentaires

Lors de la mise au point de la trousse IgG, il ne nous est pas paru possible d'augmenter la sensibilité de la trousse vis-à-vis des EM ou des neuroborrélioses en incluant des bandes supplémentaires dans l'analyse des résultats. Ces bandes sont donc décrites à titre indicatif.

Fig. 24. Bandes supplémentaires sur les blots IgG.

73 kDa : sur le cadre de lecture, c'est la première bande nette en-dessous de la p100.
66 kDa : sur le cadre de lecture, une bande nette, intense, au-dessus de la bande de 60 kDa.
58 kDa : il s'agit d'une bande étroite et de faible intensité qui est néanmoins bien visible sur le cadre de lecture, juste au-dessous de la bande de 60 kDa.
46 kDa : cette bande étroite est située à mi-chemin entre la p41 et la bande de 60 kDa.

Suivi des malades

Dans les cas de borrélioses chroniques (arthrite, acrodermatite, neuroborréliose tertiaire), le traitement nécessite une antibiothérapie massive. On demande souvent au laboratoire d'évaluer le succès de ce traitement. On notera que le Western blot n'est pas la technique idéale pour répondre à cette question mais la PCR, la culture ou les tests de détection d'antigène ne sont pas plus satisfaisants.

On appliquera à ce contexte les 4 règles suivantes :

1.	Ne rechercher que les IgG.
2.	Demander une prise de sang avant et après traitement.
3.	Veiller à ce que la deuxième prise de sang soit distante d'au moins 3 mois de la fin du traitement.
4.	Tester les 2 échantillons en parallèle avec le même coffret (ne pas se fier à une bandelette archivée correspondant à la situation avant traitement).